改良酶可以增加第二代乙醇的产量

第二代生物燃料生产的主要挑战之一是识别微生物产生的酶，用于酶的混合物以催化生物质水解，其中酶共同作用以分解甘蔗垃圾和甘蔗渣中的碳水化合物，并转化将它们分解成单糖用于发酵。

坎皮纳斯大学(UNICAMP)的一组研究人员与巴西圣保罗州坎皮纳斯的巴西生物可再生能源国家实验室(LNBR)的同事合作，发现哈茨木霉是一种在亚马逊地区发现的真菌，一种酶有潜力发挥酶鸡尾酒的关键作用。

该酶被称为β-葡萄糖苷酶，属于糖苷水解酶家族1(GH1)，在生物质降解的最后阶段起作用，产生游离葡萄糖用于发酵和转化为乙醇。然而，在实验室中，研究人员观察到高水平的葡萄糖抑制了β-葡萄糖苷酶的活性。

“我们还发现该酶的最佳催化活性发生在40°C。这代表了使用该酶的另一个障碍，因为在工业环境中，生物质的酶促水解是在更高的温度下进行的，通常在50°C左右，” Clelton Aparecido dos Santos，UNICAMP分子生物学和基因工程中心(CBMEG)的博士后研究员，获得FAPESP奖学金。

基于对酶结构与基因组学和分子生物学技术相结合的分析，研究人员能够修改结构以解决这些问题并大大提高其生物质降解效率。

该研究得益于FAPESP定期研究资助项目和FAPESP支持的专题项目。研究结果发表在“ 科学报告 ”杂志上。

“我们开发的改性蛋白质证明比未经修饰的酶更有效，可用于补充今天销售的酶混合物，以分解生物质并生产第二代生物燃料，”Santos说。

为了得到修饰的蛋白质，研究人员最初比较了原始分子的晶体结构与GH1和GH3糖苷水解酶家族中其他野生型β-葡萄糖苷酶的结构。分析结果表明，葡萄糖耐受性GH1葡萄糖苷酶比其他β-葡萄糖苷酶具有更深和更窄的底物通道，并且该通道限制葡萄糖进入酶的活性位点。

较少葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶具有较浅但较宽的活性位点入口通道，允许这些酶产生的更多葡萄糖进入生物质降解的最后阶段。保留的葡萄糖阻断蛋白质的通道并降低其催化活性。

基于这一观察结果，研究人员使用一种称为定点诱变的分子生物学技术来取代两种氨基酸，这些氨基酸可能在酶的活性位点入口处充当“看门人”，让葡萄糖或阻断葡萄糖。他们的实验分析表明，修改将通道缩小到活动部位。

“突变酶的活性位点缩小到与葡萄糖耐受的GH1β-葡萄糖苷酶相似的大小，”Santos说。

提高效率

研究人员进行了多项实验，以测量蛋白质在分解生物质方面的表现，尤其是甘蔗渣，这是一种在巴西具有巨大盈利潜力的农业工业废物。在圣保罗研究基金会-FAPESP获得奖学金的国外实习期间，Santos与英国剑桥大学教授Paul Dupree领导的一个研究小组合作，分析了不同时期定制酶的葡萄糖释放效率。植物生物质的来源被转换。

分析表明，就葡萄糖释放而言，修饰酶的催化效率比野生型酶高300%。此外，它更耐葡萄糖，因此从所有测试的植物生物质原料中释放出更多的葡萄糖。该突变还增强了酶在发酵过程中的热稳定性。

“活性位点上两个氨基酸的突变使酶效率过高。它已经为工业应用做好了准备，”UNICAMP教授兼该项目首席研究员Anete Pereira de Souza说。“这种酶的优点之一是它在体外产生，而不是来自改良的真菌或其他生物体，因此它可以以相对较低的成本大量生产。”